Polymeraskedjereaktion
Från Rilpedia
- Uppslagsordet PCR leder hit. Se även Program Clock Reference.
Polymeraskedjereaktion, engelska Polymerase Chain Reaction (PCR), är en mycket använd molekylärbiologisk och biokemisk metod, som används för att framställa stora mängder av en viss DNA-sekvens. Detta sker genom en kemisk reaktion i flera steg utförd med hjälp av ett enzym av typen DNA-polymeras. PCR är kanske den viktigaste upptäckten inom molekylärbiologin. Processen uppfanns av Kary Mullis som 1993, endast sju år efter att uppfinningen först publicerades, fick Nobelpriset i kemi för sin upptäckt. Idag används PCR både inom forskning och klinisk diagnostik, och PCR-baserade metoder används även inom kriminologi och för att fastställa släktskap, faderskap med mera.
Som metod simulerar PCR i någon mån cellens sätt att vid celldelning göra nya kopior av kromosomernas DNA-kedjor, men man har ersatt en stor mängd enzymer med en cykel av temperaturväxlingar. Det enda enzym som behövs är själva polymeraset, som bygger en ny nukleotidkedja med en redan befintlig sådan som mall. I vanlig PCR använder man normalt dubbelsträngat DNA som mall för att göra nya kopior av; detta DNA brukar benämnas templat.
Metoden kräver två korta DNA-snuttar av oligonukleotider som kallas primers; en som binder till vardera av ursprungs-DNA:ts strängar. Avståndet mellan dessa primers bestämmer hur stor den tillverkade DNA-kopian, amplikonet, blir. DNA-fragment mellan 100-5000 baspar brukar gå lätt att åstadkomma med denna metod.
PCR:s temperaturcykel börjar med att man denaturerar DNA-molekylens strängar vid hög temperatur. När lösningen med de denaturerade DNA-strängarna får svalna kan primrarna binda till ändarna av den sekvens som ska kopieras (amplifieras). Enzymet DNA-polymeras bygger sedan en ny sträng av DNA med primern som start. Sedan börjar man om från början, smälter isär DNA-kedjorna och bygger nya. En normal PCR brukar köras i 20-30 cykler. Mängden amplikon ökar exponentiellt enligt 2n där n är antalet cykler.
För att denaturera de bägge strängarna används temperaturer på cirka 95 grader Celsius, en temperatur vid vilken de flesta proteiner denatureras och så även DNA-polymeras från de flesta organismer. Man använder därför ett värmetåligt polymeras som ursprungligen kommer från arkén Thermus aquaticus och därför ofta benämns Taq-polymeras. Idag är dock de flesta polymeras som säljs för ändamålet genetiskt modifierade, därför att det ursprungliga Taq-polymeraset saknar korrekturläsningsförmåga vilket leder till en hög mutationsfrekvens.
Olika former av PCR
- Konventionell PCR
Två primrar används med DNA som målmolekyl som beskrives ovan. En enkel PCR-maskin för reglering av temperatur kan användas.
- RT-PCR, Reverse Transcriptase PCR
Fungerar som vanlig PCR men man utgår från RNA som görs om till cDNA. Därmed kan man studera uttrycket av en viss gen och göra s.k. expressionsanalys.
- Q-PCR eller Realtids-PCR, Quantitative PCR, Kvantitativ PCR
Används för att detektera och kvantifiera mängden DNA i provet med hjälp av fluorescenta prober eller fluorescent infärgning. En särskild maskin för reglering av temperatur och avläsning av fluorescens behövs, vanligen i kombination med en dator.
- QRT-PCR, Quantitative Reverse Transcriptase PCR
En kombination av de två senast ovanstående. Via cDNA kvantifieras mängden RNA i provet och en noggrannare expressionsanalys kan göras.
Se även
- Wikimedia Commons har media som rör Polymeraskedjereaktion
- RT-PCR
- real-time PCR
- http://www.gene-quantification.info - The reference in real-time PCR
