Enzymkopplad immunadsorberande analys
Från Rilpedia
Enzymkopplad immunadsorberande analys, eng. Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) används för att kvantifiera och detektera en antikropp eller ett antigen. Principen är att ett antigen binds till vägggar och / eller botten i brunnarna i en mikrotiterplatta.
Till brunnarna sätts sedan ett prov med den antikropp, riktad mot antigenet, som skall bestämmas. Sedan antikropparna i provlösningen bundit sig tvättas komponenter i provet som inte bundits bort. Därefter tillsätts en lösning med en sekundär antikropp från ett annat djurslag (tracern) som enbart har specifictet för den primära antikroppen. Till tracern har man kopplat (konjugerat) ett enzym (t ex pepparrotsperoxidas eller alkaliskt fosfatas). Överskottet av tracer tvättas bort och det enzym som finns kvar bundet ger sedan i nästa steg en signal genom en enzymreaktion där produkten är ett färgat eller fluorescent ämne. Detta bestäms med specialanpassad fotometer. Signalen är direkt relaterad till mängden bunden tracer. En vanlig reaktion är till exempel att alkaliskt fosfatas får katalysera hydrolysen av p-nitrofenylfosfat (vattenlösligt och färglöst) till p-nitrofenol (starkt gult i alkalisk lösning, med absorptionsmaximum vid 405 nm) och fosfat.
Metoden används på kliniska laboratorier för att bestämma antikroppar som produceras som svar på en virusinfektion eller en autoimmun sjukdom eller för att bestämma andra sjukdomsrelaterade eller fysiologisk aktiva ämnen, t ex cancermarkörer. I en del fall kan också lågmolekylära ämnen, t ex hormoner, vissa substanser relaterade till nukleinsyror, växtgifter, dopingmedel eller andra helt syntetiska ämnen (som t ex används som mediciner) bestämmas. Även inom livsmedelsindustrin finns tillämpningar. För specifika nukleinsyresekvenser använder man andra metoder, se PCR.
Många ELISA-bestämningar görs i stora analysrobotar utan mänsklig inblandning, dels för att förbilliga (arbetskraft är dyr) och dels för att standardisera bestämningen (varje labbtekniker arbetar på sitt eget invanda sätt, och det blir alltid små variationer mellan olika laboranter). För de vanligaste bestämningarna finns färdiga reagenssatser (kit) med reagens som är väl anpassade till varandra och standardiserade hos tillverkaren. Reagens för ELISA räknas till gruppen diagnostika, som definieras som reagens för klinisk-kemiska analyser som inte kan göras med konventionella kemiska metoder.
I en besläktad bestämningsmetod är tracerantikroppen direkt konjugerad till en fluorescent grupp (fluorofor) i stället för ett enzym.
Indirekt ELISA
Vid indirekt ELISA täcks en mikrotiterplatta med antigen som binds till botten och väggar i mikrotitrerplattan. Sedan sköljs det antigen som inte bundit till plattan bort. Efter detta droppas provet på mikrotitrerplattan, och antikroppar i provet binder till antigenet på plattan. Efter inkubationen med provet tvättas återigen obundna komponenter bort. Därefter tillsätts en lösning av en antikropp (s. k. "tracer") som binder specifikt till antikroppen i provet. Till denna andra antikropp, "tracer", har kopplats (konjugerats) ett enzym som kan detekteras, och härmed kan också förekomsten av antikroppar i provet bestämmas.
Sandwich-ELISA
Sandwich-ELISA innebär detektering av en antigen. En Mikrotiterplatta bestryks, coatas, med antikroppar som binder till det antigen i provet man vill bestämma. En andra antikropp, riktad mot en annan epitop på det antigen man vill bestämma. Denna andra antikropp (tracern) är i sin tur konjugerad med ett enzym som kan detekteras.
Inhibitions-ELISA
I denna teknik låter man först provet med den antikropp man vill bestämma reagera med antigenet, som är bundet på mikrotiterplattans yta. I nästa steg sätter man till en "tracer". Denna "tracer" är av exakt samma typ av antikropp, riktad mot exakt samma antigen som den i provet, men med enzym konjugerat, d v s bundet till sig. Ju mer antikropp det fanns i provlösningen, desto mindre plats finns det nu för tracer-antikroppen att binda till antigenet på mikrotitrerplattan. Här kommer alltså en större halt antikroppar i provet att ge upphov till en lägre signal. Utom den "sekventiella" metod som beskrivs här, kan bestämningen också göras "kompetitivt", d v s genom att prov och tracer tillsätts på mikrotitrerplattan samtidigt. Noggrannheten i testet blir då något lägre, men i gengäld sparar man ett steg i analysgången och förenklar den.
I samtliga av dessa tekniker är det möjligt att kasta om ordningen på antigen och antikropp, och t ex koppla antikropp till mikrotitrerplattan och/eller att konjugera ett antigen till enzym och använda denna som tracer.
Se också: Klinisk kemi
