Vektor (genteknik)
Från Rilpedia
- Se även vektor (smittspridning).
Vektor är inom genteknik och molekylärbiologi ett redskap för att föra in DNA i levande celler. Vanligt använda vektorer är plasmider och modifierade virus.
Innehåll |
Plasmider
En plasmid är ett cirkulärt DNA, omkring 5000 nukleotider (baspar) långt, som kan klyvas med restriktionsenzymer. Dessa är enzymer som klyver vid en specifik DNA-sekvens som ser olika ut beroende på vilket enzym som används. Plasmiderna innehåller ett stort antal restriktionsställen där restriktionsenzymerna kan klyva. Klyvningen kan gå till på två olika sätt, antingen rakt av (blunt ends) eller överlappning. Vid en överlappning bildas det två ändar som är enkelsträngade (DNA är vanligen dubbelsträngat). För att klona in en DNA bit, tillsätts den önskade DNA-biten (exempelvis en gen) i överskott. Det gäller att genen har en DNA-sekvens som passar in på den plats i vektorn där man klippt med restriktionsenzymet. För att få ihop vektorn med DNA-biten används ett ligeringsenzym.
Transfektion (överföring) För att få in vektorn i cellen eller bakterien finns det olika tekniker, antingen elektroporering, vilket innebär att cellen utsätts för en ström som skapar temporära hål i cellmembranet där vektorn kan ta sig in. En annan teknik är att använda sig av kalciumfosfat för transformation med värmechock.
Selektion Då bakterierna haft möjligheten att ta upp vektorn måste man skilja på de bakterier som tagit upp vektorn från dem som inte tagit upp den. Detta görs genom att odla bakteriena på en agarplatta, förutom agarn som är näring för bakterierna så innehåller plattan ett antibiotikum. Plasmid DNA vektorn innehåller en eller flera gener som kodar för proteiner som gör bakterierna antibiotikaresistenta. Endast de bakterier som tagit upp vektorn och uttrycker proteinet kommer därför att överleva.
I naturen använder sig bakterier av plasmider för att kunna överföra genetisk information mellan två bakterier. Ett exempel är antibiotikaresistens som sprids på detta sätt. Problemet är det är inte begränsat inom den egna arten utan kan ske mellan två olika bakteriearter.
Virala vektorer
Virus kan delas in i två grupper de som sätter in sitt DNA eller RNA i värdcellen (kromosomalt)retrovirus och de som sätter det episomalt ex. adenovirus. Skillanden är att det som satts in kromosomalt kommer att föras över vid nästa celldelning, till skillnad från det episomala. Syftet med virus är att använda deras naturliga förmåga att ta sig in i cellen och sätta in sin egen arvsmassa i värdcellens genom. Konsekvensen blir att cellen börjar att tillverka virus istället för vad den normalt skulle göra. Just detta beteende är vad man hade hoppats kunna utnyttja inom genterapin genom att få viruset att åtgärda ett fel i cellen. Primära användningsorådet är att kunna behandla sjukdomar som endast beror på ett fel i en gen exempelvis SCID. Det stora problemet med virala vektorer är att om de sätter in genen, på fel plats så kan de störa den naturliga cellregleringen. Konsevensen av detta blir bildandet av en cancercell. Det är just det stora problemet med de virala vektorerna även om man lyckats att bota sjukdomen så har många personer sedan utvecklat någon from av cancer. Lösningen på detta problem har varit att försöka att ta bort så mycket av det virusets egna genom.
Icke virala
På grund av de problem som virala vektorer, så har man även försökt att utveckla icke virala vektorer. Exempel på ickevirala vektor är en micell bestående av ett lipofilt ytterlager. I mitten av micellen ligger DNAt, när micellen möter cellmembranet skall dessa två smälta samma och på så sätt skall man få DNA. Problemet är att än så länge är effektiviteten alldeles för låg.
