DNA-sekvensering
Från Rilpedia
DNA-sekvensering är den process som används för att med biokemiska metoder bestämma ordningen av kvävebaserna (nukleotiderna) adenin, guanin, cytosin och tymin i DNA. DNA-sekvensen utgör den ärvda genetiska informationen i celler och bestämning är därför viktig både i grundläggande forskning kring organismer inom det fält av biologin som kallas "systematisk biologi" och i tillämpade områden såsom rättsmedicinska utredningar. DNA-sekvensering är också mycket viktigt för att identifiera ärftliga sjukdomar och, i förlängningen, hur man skall bota dem.
Den snabba utvecklingen inom området har möjliggjort storskaliga sekvenseringar av till exempel det mänskliga genomet.
Innehåll |
Historik
Maxam-Gilbert sekvensering
1976-77 utvecklade Allan Maxam och Walter Gilbert en DNA-sekvenseringsmetod baserad på kemisk modifikation av DNA med efterföljande delning vid specifika baser. Metoden blev mer populär än den två år tidigare publicerade plus-minussekvenseringsmetoden utvecklad av Sanger och Cuolson, eftersom renat DNA kunde användas direkt, medan den ursprungliga Sanger-metoden förutsatte en del förarbete.
Allt eftersom chain-termination-metoden har utvecklats och förbättrats har Maxam och Gilberts metod kommit att användas allt mindre. Den är jämförelsevis komplex, kräver omfattande användning av farliga kemikalier och är svår att använda storskaligt. Dessutom är det svårt att anpassa kemikalierna som används i Maxam-Gilbertmetoden för att passa ett standardkit, vilket är möjligt med chain-termination-metoden
Metoden kräver radioaktiv märkning av ena änden och rening av DNA fragment som ska märkas. Kemisk behandling bryter en liten andel av DNA-kedjorna i en eller två av de fyra nukleotiderna (G, A+G, C, C+T). På grund av detta skapas ett antal märkta fragment, från den radioaktivt märkta änden till första avbrottet i varje molekyl. De olika fragmenten separeras sedan med gelelektrofores, där de fyra olika reaktionspunkterna är arrangerade sida vid sida. För att åskådliggöra de fragment som genereras i varje reaktion får gelen exponera en röntgenstrålningsfilm, som ger en bild med en serie av band som motsvarar de radioaktivt inmärkta fragmenten. Utifrån denna kan man sluta sig till sekvensen.
Metoden benämns ibland 'kemisk sekvensering' och har sitt ursprung i studier av DNA-proteiners interaktion, nukleinsyrans struktur och epigenetisk modifikation av DNA, områden där metoden fortfarande har viktiga användningsområden.
Kedje-termineringsmetoden
Medan den kemiska sekvenseringsmetoden, framtagen av Maxam och Gilbert, och plus-minusmetoden framtagen av Sanger och Coulson var betydligt snabbare än tidigare metoder, var kedje-terminerigsmetoden som utvecklades av Sanger ännu effektivare, och blev snabbt den mest använda. I Maxam-Gilbert-metoden användands giftiga kemikalier och radioaktivt märkt DNA i betydligt högre grad än i kedje-termineringsmetoden. Huvudprincipen bakom Sangers metod är användandet av dideoxy-nukleotider. Tekniken är idag mycket använd för situationer där man vill sekvensera mindre fragment av DNA. För större mängder av DNA, såsom ett helt genom, finns det andra metoder som är mer lämpliga, såsom shotgun sekvensering och den svenskutvecklade pyrosekvenseringen.
Dideoximetoden går till så att en viss mängd av det DNA (templat) som ska sekvenseras blandas med en mindre mängd speciella s.k. dideoxinukleotider, vanliga trifosfatnukleotider, ett DNA-polymerase, en primer och därefter initieras ett normalt PCR-program i termocyklern. Dideoxinukleotiderna är derivat av normala trifosfatnukleotider, och saknar både OH-grupp på 2'-kolet men även på 3'-kolet. Dideoxinukleotiderna är även inmärkta med fluoroforer: en fluorofor för varje ddNTP (ddATP, ddCTG, ddGTG samt ddTTP). Eftersom dideoxinukleotiderna är färre till antalet än de vanliga nukleotiderna är det högre sannolikhet att en vanlig nukleotid inkorporeras, men när en dideoxinukleotid byggs in av DNA-polymeraset termineras elongeringen eftersom OH-grupp saknas på 3'-kolet.
Efter PCR-körningen har man i provröret en blandning av templat med olika längd. Blandningen blir föremål för gelelektrofores med en upplösning på enskilda baspar. Man kan således läsa av nukleotidsekvensen direkt på gelen eftersom fluoroforerna avger olika färg.
Metodik
DNA-sekvensering sker idag främst genom den s.k. Sanger-dideoxy-metoden. Metoden kräver att ett mycket stort antal kopior av det DNA-fragment man önskar sekvensera finns tillgängligt. För att erhålla dessa kopior räcker det med ett fåtal ursprungliga kopior (t.ex. dem som erhålls genom DNA-extraktion ur en organism) samt tillgång till PCR-apparatur.
En annan metodik för sekvensering av kortare DNA-segment kallas för pyrosekvensering och baseras på reaktioner där inbindandet av nukleotider till en komplementär DNA-sträng ger upphov till en ljusreaktion. Ljuset mäts av en fotometer och representeras i en kurva som kan följas direkt på en datorskärm. Ljusreaktionens intensitet är proportionerlig mot antalet inbundna nukleotider och eftersom endast "rätt" nukleotid kan binda in vid ett givet tillfälle kan man utläsa ordningsföljden.
Se även
Referenser
- F. Sanger, S. Nicklen, A.R. Coulson. 1977. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74: 5463-5467.
- A. Ahmadian, M. Ehn, S. Hober. 2006. Pyrosequencing: History, biochemistry and future. Clinica Chimica Acta 363(1-2): 83-94
