Kvantitativ realtids-PCR
Från Rilpedia
Kvantitativ direktanalyserad PCR (eng. Real time PCR även kallad q-PCR), är en molekylärbiologisk metod som används för att mäta mängden av visst DNA eller RNA i en vävnad eller en grupp av celler.
Principen vid Real-time-PCR bygger till stor del på den vanliga PCR-tekniken där det templat som är av intresse amplifieras under processen. Resultatet blir miljontals identiska kopior av det DNA-fragment som är av intresse. Skillnaden ligger i att en speciell fluorescerande molekyl "reporter" börjar fluorescera för varje nytt DNA-fragment som skapas. Detta kan åstadkommas på två sätt. Antigen använder man en "probe", ett mindre DNA-fragment som binder till mitten av det DNA-fragment man vill amplifiera. Denna probe har en reportermolekyl som har förmågan att fluorescera i ena ändan, och en quencher med förmåga att släcka ut reporterns flueroscens i andra. Quenchern fungerar dock endast då den är mycket nära reportern, när proben är intakt. Då DNA-fragmentet amplifieras i PCR-metoden vandrar ett enzym (DNA polymeras) längs DNA-fragmentet och läser av detta. När det enzymet kommer till proben klyvs denna och reportern separeras från quenchern, och fluorescensen kan mätas av q-PCR-instrumentet. Det andra sättet att åstadkomma fluorescens är att i PCR-lösningen ha en instabil molekyl SYBR green) som endast kan emittera fluorescens i en bestämd konfiguration. Molekylen binder ospecifikt till allt dubbelsträngat DNA i just den konfigurationen som krävs för att fluorescens skall kunna mätas. Skillnaden mella de två metoderna blir att med probe erhålls fluorescens endast då det tilltänkta målfragmentet amplifieras, medan SYBR green även ger signal vid ospecifik amplifiering och s.k. "primer-dimer" fenomen.
Poängen med metoden är att kunna mäta mängden DNA eller RNA som fanns i lösningen innan reaktionen började. Eftersom PCR-metoden amplifierar målgenen exponentiellt kommer fluorescensen öka mycket kraftigt någon gång under reaktionen. Tidpunkten då detta inträffar står i relation till mängden startmaterial som fanns i röret, det är alltså när den cykliska PCR-reaktionen är klar man kan "räkna bakåt". Också detta kan göras på två sätt: antingen i absoluta tal eller som kvot i relation till en annan gen. För att kunna ange ett antal kopior av DNA-fragmentet i startmaterialet måste man parallellt med sitt prov köra en "standardkurva", där man använder en tidigare känd mängd DNA eller RNA i varje reaktion. Genom att jämföra när den exponentiella fasen inträffar jämfört med dessa standardreaktioner kan man räkna ut hur många kopior som fanns av ens måltemplat. Den andra metoden kallas relativ kvantifiering (RQ). Metoden går ut på att mängden av transkriptet mäts i förhållande till ett universellt referenstranskript som existerar i de flesta celltyper (housekeepinggen). En vanlig housekeepinggen är GAPDH, som är namnet på ett enzym som deltar i ett essentiellt steg i glykolysen. Även beta-aktin används i många fall.
I detalj går processen till på det viset att RNA renas fram från vävnaden eller cellkulturen, därefter omvandlas RNAt till komplementärt DNA (cDNA) med hjälp av enzymet omvänt transkriptas (se RT-PCR). Detta steg är nödvändigt då RNA är en mycket instabil molekyl som aldrig skulle tåla de höga temperaturer som är nödvändigt vid PCR. cDNA har en annan kemisk struktur men innehåller samma information.
